Trestní řízení je těžištěm působnosti státního zastupitelství a k jeho výkonu je přímo zavazováno Ústavou ČR. Ačkoli hlavní působnost státního zastupitelství spočívá v trestním řízení, je tato působnost vyjádřena v zákoně o státním zastupitelství poměrně stroze. V podstatě jde o zprostředkovaný odkaz na trestní řád, čemuž nasvědčuje užitá formulace: „[…] je orgánem veřejné žaloby v trestním řízení a plní další úkoly vyplývající z trestního řádu“. Do účinnosti novely zákona o státním zastupitelství, provedené zákonem č. 14/2002 Sb., byl jeho § 4 odst. 1 vyjádřen tak, že státní zastupitelství podávalo jménem státu obžalobu v trestním řízení a plnilo povinnosti, které mu v souvislosti s tím trestní řád ukládal. Obžalobu nepodalo pouze v případech, které stanovil trestní řád. Nyní má citované ustanovení restriktivní podobu, jeho podstata však zůstává totožná, jelikož platí, že státní zastupitelství je orgánem veřejné žaloby v trestním řízení a plní další úkoly vyplývající z trestního řádu.

Státní zástupce vystupuje v pozici orgánu činného v trestním řízení, přičemž jsou mu svěřeny pravomoci ve všech stádiích trestního řízení. Státní zástupce je vybaven určitými procesními právy a současně jsou mu uloženy odpovídající procesní povinnosti.

V přípravném řízení trestním je státní zástupce dominujícím orgánem – v této souvislosti se používá termínu „dominus litis“. Státní zástupce v něm vykonává dozor nad zachováním zákonnosti. Za účelem objasnění věci a zjištění pachatele je zmocněn ukládat policejnímu orgánu provedení úkonů, ke kterým je tento orgán oprávněn. K prověření skutečností nasvědčujících spáchání trestného činu může státní zástupce vyžadovat od policejního orgánu spisy, dokumenty, materiály a zprávy o jeho postupu. Dále může věc policejnímu orgánu odnímat a přikazovat, neprodleně musí vyřizovat žádosti osoby, proti které se řízení vede, a poškozeného o odstranění průtahů řízení a závad v postupu policejního orgánu (§ 157a tr. ř.). Při výkonu dozoru v přípravném řízení je státní zástupce oprávněn dávat závazné pokyny k vyšetřování trestných činů, zúčastnit se provádění úkonů policejního orgánu nebo sám provést jednotlivý úkon, vracet věc se svými pokyny policejnímu orgánu k doplnění, rušit rozhodnutí a opatření policejního orgánu, jsou-li nezákonná a neodůvodněná, a může je nahrazovat vlastními.

V přípravném řízení je výhradně státní zástupce oprávněn k některým úkonům, jde o: rozhodnutí o postoupení věci jinému orgánu (§ 171 tr. ř.), o zastavení trestního stíhání (§ 172 tr. ř.), o přerušení trestního stíhání (§ 173 tr. ř.), dále může podat obžalobu, rozhodnout o podmíněním zastavení trestního stíhání (§ 307 tr. ř.), narovnání (§ 309 tr. ř.) a o propuštění z vazby.

Státní zástupce je dále oprávněn nařídit nebo zrušit zajištění majetku obviněného, provést zajištění nároku poškozeného na náhradu škody, nařídit exhumaci mrtvoly. Státní zástupce je oprávněn požadovat údaje, které jsou předmětem bankovního tajemství, údaje z evidence cenných papírů, a některé osobní údaje a údaje získané při správě daní (§ 8 odst. 2 tr. ř.), zajistit nástroje trestné činnosti nebo výnosy z trestné činnosti (§ 79a tr. ř.), a náhradní hodnoty (§ 79g tr. ř.), zajistit majetek obviněného k zajištění nároku poškozeného (§ 47 tr. ř.), zajistit majetek obviněného (§ 347 tr. ř.) a udělit souhlas k pohřbení mrtvoly při podezření z trestného činu (§ 115 tr. ř.). Státní zástupce rozhoduje o zásazích do osobních práv: je oprávněn vyzvat k vydání věci (§ 78 tr. ř.), nařídit odnětí věci (§ 79 odst. 1 tr. ř.), osobní prohlídku (§ 83b odst. 1 tr. ř.), zadržení zásilky (§ 86 odst. 1 tr. ř.), sledování zásilky (§ 87b odst. 1 tr. ř.). Státní zástupce podává návrh, aby soud vzal obviněného do vazby (§ 73b odst. 1 tr. ř.) nebo aby vydal příkaz k zatčení (§ 69 odst. 1 tr. ř.), aby nařídil domovní prohlídku (§ 83 odst. 1 tr. ř.). Státní zástupce dává souhlas policejnímu orgánu k zadržení osoby podezřelé (§ 76 odst. 1 tr. ř.), k vydání příkazu k odnětí věci (§ 79 odst. 1 tr. ř.), k nařízení osobní prohlídky (§ 83b odst. 1 tr. ř.). Při použití operativně pátracích prostředků uděluje písemné povolení k předstíranému převodu (§ 158c odst. 2 tr. ř.), ke sledování osob a věcí (§ 158d odst. 2 tr. ř.) a státní zástupce vrchního státního zastupitelství podává návrh, aby soudce vrchního soudu povolil použití agenta.

Před zahájením trestního stíhání je státní zástupce povinen přijímat oznámení o skutečnostech nasvědčujících, že byl spáchán trestný čin (§ 158 odst. 2 tr. ř.). V případě, že policejní orgán neskončí prověřování oznámení ve lhůtách určených v § 159 odst. 1 tr. ř., je státní zástupce oprávněn tyto lhůty prodloužit a pokynem policejnímu orgánu určit úkony, které má provést. Usnesení policejního orgánu o odložení věci může státní zástupce ve lhůtě 30 dnů od doručení zrušit, případně nahradit vlastním rozhodnutím. Státní zástupce dává policejnímu orgánu souhlas k dočasnému odložení trestního stíhání (§ 159b tr. ř.) a k případnému prodloužení lhůt jeho trvání. Státní zástupce je oprávněn rozhodnout o zahájení trestního stíhání, třebaže je pravidlem, že ve většině případů tak činí policejní orgán, jemuž je tento institut svěřen.

Ve zkráceném přípravném řízení, tedy v řízení kde trestní sazba nepřekračuje 5 let a podezřelý byl přistižen přímo při činu nebo bezprostředně po něm nebo pokud lze očekávat, že podezřelého bude možno postavit před soud nejpozději do 14 dnů (lze si představit například zloděje přistiženého při krádeži), je státní zástupce na základě zprávy předložené policejním orgánem oprávněn podat soudu návrh na potrestání (§ 179c odst. 2 tr. ř.). Pokud tak neučiní policejní orgán, je státní zástupce oprávněn věc odložit, odevzdat jinému orgánu ke kázeňskému nebo kárnému projednání nebo pro přestupek, vrátit policejnímu orgánu k provedení dalšího úkonu, nebo v případě překvalifikace skutku na trestný čin vylučující zkrácené přípravné řízení předat věc k zahájení trestního stíhání. Po posouzení okolností případu je oprávněn prodloužit lhůtu pro skončení zkráceného přípravného řízení, nařídit policejnímu orgánu zahájení trestního stíhání, případně za tímto účelem věc předat orgánu oprávněnému konat vyšetřování.

Státní zástupce podáním obžaloby (návrhu na potrestání) dává podnět k tomu, aby soud mohl zahájit řízení před soudem, u něhož tuto obžalobu (návrh na potrestání) zastupuje. Státní zástupce je povinen účastnit se hlavního líčení, na počátku přednáší obžalobu, na závěr prezentuje závěrečnou řeč. Z vlastní iniciativy, popř. k žádosti předsedy senátu, je oprávněn na podporu obžaloby nebo z hlediska podané obžaloby opatřovat i další dosud neopatřené nebo neprovedené důkazy, může navrhovat provedení potřebných důkazů, které v obžalobě nebyly navrženy, a tyto důkazy se souhlasem předsedy senátu provést.

Státní zástupce jako jediný subjekt trestního řízení zahajuje jednání o dohodě o vině a trestu, a to buď na návrh obviněného, nebo i bez tohoto návrhu. Následně se účastní celého sjednávání a dohodu předkládá soudu ke schválení.

Státní zástupce je oprávněn podat stížnost proti usnesení soudu, a to i v neprospěch dotčené osoby.

Státní zástupce je oprávněn podat odvolání proti rozsudku pro nesprávnost kteréhokoli výroku. Odvolání může podat jak ve prospěch, tak i v neprospěch obžalovaného. Pokud nemá státní zástupce postavení odvolatele, má právo se k odvolání ve veřejném zasedání vždy vyjádřit a učinit návrhy na provedení dokazování.

Dovolání je oprávněn podat nejvyšší státní zástupce, může tak učinit z vlastní iniciativy nebo na návrh krajského nebo vrchního státního zástupce.

Dále je státní zástupce oprávněn podat návrh na povolení obnovy řízení ve prospěch i v neprospěch obviněného.

V řízení proti mladistvému je státnímu zástupci uložena povinnost být vždy přítomen nejen u hlavního líčení, ale i ve veřejném zasedání (§ 234 odst. 2 tr. ř., § 64 odst. 2 zákona č. 218/2003 Sb., o soudnictví ve věcech mládeže). O konání řízení proti uprchlému může soud rozhodnout i na základě návrhu, který státní zástupce může učinit již v obžalobě, ale také po jejím podání (§ 305 tr. ř.).

V řízení před samosoudcem, kde se koná zjednodušené řízení ve věcech, v nichž se konalo zkrácené přípravné řízení, se zahajuje trestní stíhání teprve doručením návrhu státního zástupce na potrestání soudu. Po nabytí právní moci rozhodnutí o odmítnutí návrhu na potrestání, nejsou-li splněny podmínky pro konání zjednodušeného řízení, se věc vrací do přípravného řízení a státní zástupce nařídí konání vyšetřování. Při hlavním líčení ve zjednodušeném řízení je přečtení úředních záznamů o vysvětlení osob a provedení dalších úkonů vázáno také na souhlas státního zástupce.

Rozhodování o odklonech v přípravném řízení patří mezi výhradní rozhodovací pravomoci státního zástupce. Pokud jsou pro to dány zákonné podmínky, může státní zástupce se souhlasem obviněného v přípravném řízení rozhodnout o podmíněném zastavení trestního stíhání (§ 307 tr. ř.) a o schválení narovnání (§ 309 tr. ř.). Ve vykonávacím řízení státní zástupce navrhuje změnu způsobu výkonu trestu odnětí svobody, podmíněné propuštění z trestu odnětí svobody, upuštění od ochranného léčení a propuštění z ochranného léčení nebo jeho ukončení.

Státní zástupce má řadu pravomocí i v rámci právního styku s cizinou.